FRM1基因突變檢測試劑盒

人類SMN1/DMD/FRM1基因突變檢測試劑盒

        假肥大性肌營養不良癥（DMD）是最常見的X連鎖隱性遺傳的肌病，發病率為1/3500活產男嬰，無明顯地理或種族差異，患兒多呈明顯家族性，另有1/3由新發突變而致病。DMD基因的突變是導致假肥大性肌營養不良癥的主要病因，最常見的類型是缺失型，約占55%~65%，以第44-45號、第2-19號外顯子間最為多見；基因重復占5%~15%；點突變占30%左右。
        脊髓性肌萎縮癥（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一種源于脊髓前角退變引起肌無力和肌萎縮的神經系統遺傳性疾病，屬于常染色體隱性遺傳病?；町a嬰兒的發病率為1/6000~1/10000，人群攜帶者頻率為1/40~1/50，居兒童致死性常染色體遺傳病的第2位。運動神經元存活基因1（SMN1）的外顯子純合缺失（90%~95%）或SMN1缺失/點突變（或部分缺失）（3~5%）的復合雜合突變是導致該疾病發生的主要原因。運動神經元存活基因2（SMN2）基因會轉錄產生10~20%全長有功能的轉錄本，因此在SMA病人中，SMN2基因拷貝數與臨床表型嚴重程度密切相關。
       脆性X綜合征（fragile X syndrome，FXS）是最常見的X連鎖隱性遺傳的單基因性智力低下綜合征，占所有X-連鎖智力低下疾病的15%~25%，發病率僅低于21-三體綜合征。超過99%的脆性X綜合征患者是由FMR1基因三核苷酸重復序列（CGG）n擴增和超甲基化所致。全突變（n≥200）的患者多為男性，在男性人群中的發病率為1/6000~1/4000，女性的發病率約為1/8000。全突變的男性患者及部分女性患者將智力低下生活無法自理，終身無法治愈，給家庭和社會帶來沉重負擔。FMR1基因的前突變（n＝55~199）與女性卵巢儲備功能下降、復發性流產、卵巢功能早衰、不孕不育、IVF失敗有關，與男性成年后的震顫/共濟失調有關。55xCGG重復是一個分水嶺，小于55x個體表型通常正常，后代發生突變的可能性也很低，但大于55x是前突變/全突變攜帶者或患者，而且后代傳遞中有較高頻率突變為全突變從而產生更為嚴重的臨床癥狀。
        上述三種遺傳病發病率高、致死/致殘率高，幾乎沒有有效的治療手段，但卻是可以通過對備孕人群或已妊娠人群進行對應基因的突變篩查預防絕大部分患兒的出生。美國婦產科年會（ACOG）在“基因組醫學時代下的攜帶者篩查”的專家共識中，脆性X綜合征和脊髓性肌萎縮癥是向所有備孕人群或已妊娠人群強烈推薦篩查的2種疾病。

        人類SMN1/DMD/FMR1基因突變檢測試劑盒通過采集人基因組DNA，應用公司自主研發且具有自主知識產權的AccuCopy®多重熒光競爭性PCR（授權專利號：ZL201010180551.2，Du etal，2012）用于SMA（SMN1及SMN2）和DMD基因的拷貝數檢測。應用特殊熒光CGG重復PCR技術來進行FXS的FMR1 CGG重復數的檢測。該檢測產品主要的展開領域為婦產科，作為SMA/DMD/FXS的攜帶者篩查對所有備孕期或孕早期的女性進行普篩，篩查出高危人群，及時進行產前診斷，有效避免嚴重遺傳病患兒的出生。

        對于DMD，檢測高頻突變的34個外顯子的拷貝數，預計能覆蓋現有報導95%以上的拷貝數變異，若檢測到陽性樣本，可采用本公司“人類DMD基因突變檢測試劑盒”驗證，該試劑盒覆蓋全部79個外顯子，可進一步明確具體的缺失范圍。此外，該三聯檢試劑盒中包含的20個點突變位點均為文獻報道5次以上的熱點突變，可進一步提高3~5%檢出率。
        對于SMA，可檢測SMN1及SMN2的拷貝數，部分外顯子缺失重復突變以及10個高頻點突變，其中含3個歐洲人群特有高頻位點。此外，該試劑盒還可對g.27134T＞G進行分型，該SNP位點的G等位基因據報道與雙SMN1基因連鎖顯著相關，檢出該G等位基因的SMN1拷貝數為2的個體可能為2+0型高危個體，建議進行父母檢測輔助分析排除。
對于FMR1，主要檢測FMR1基因的CGG重復數，通過本項檢測可判斷是否存在大于或等于55x的重復突變。對于陽性樣本，建議采用美國進口AmplideX試劑盒進行CGG具體重復數的確認。

        SMN1、SMN2和DMD基因的拷貝數檢測采用的是公司自主研發且具有自主知識產權的AccuCopy®多重熒光競爭性PCR技術；SMN1和DMD的點突變檢測則采用多重熒光ARMS法；FMR1 CGG 重復突變篩查采用特殊熒光CGG重復PCR法。

        通過取一定量的競爭性DNA片段混合物（每個競爭性DNA片段與各自對應基因片段通常僅有2-3bp差別），然后與合適量的檢測樣本DNA混合，隨后利用多重熒光PCR引物對檢測樣本DNA及競爭性DNA片段混合物進行參照基因片段和目標基因片段的擴增；多重PCR產物經熒光毛細管電泳后根據擴增長度差異進行分離，獲取不同基因片段的檢測樣本峰（S）以及競爭性DNA峰（C）的峰高值；分析每個基因片段的S/C峰高比值（稱R值），然后將目標基因R值除以參照基因R值獲得RR值(用于校正不同檢測樣本DNA用量差異)，通過將檢測樣本的RR值除以參照樣本的RR值（用于校正不同基因片段對應競爭性DNA的用量差異）后再乘以參照樣本在該目標基因上的拷貝數即可獲得目標基因的精確拷貝數。